Виросомы: старая форма, новое содержание

Природа создала множество биологических наноустройств и наномашин, элементы которых могут быть перепрограммированы для решения задач современной биологии и медицины. Одна из областей их применения — биофармацевтика. Молекулы белка, ДНК, РНК и их комплексы успешно применяются для конструирования терапевтических препаратов и вакцин. Это основа медицины будущего, которая будет базироваться на применении интеллектуальных лекарств, избирательно действующих на инфекционные агенты или на биополимеры, определяющие функционирование клеток человека.

Об авторах

Анастасия Леонидовна Алексеева — аспирантка, сотрудница лаборатории биохимии нуклеиновых кислот Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск), Автор и соавтор 4 научных работ.

Александра Ильинична Неуместова — аспирантка, сотрудница лаборатории биохимии нуклеиновых кислот Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск).

Марина Аркадьевна Зенкова — доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией биохимии нуклеиновых кислот Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск). Автор и соавтор 252 научных работ и 18 патентов.

Вирусам, как важнейшему и хорошо изученному классу биологических нанообъектов, уже нашлось применение в прикладной медицине и разного рода фундаментальных исследованиях. Модифицируя вирусные геномы, ученые получают инфекционные агенты, избирательно поражающие раковые клетки; «ослабленные» вирусные частицы используют как живые вакцины; бактериофаги (вирусы-убийцы бактерий) — применяются в сельском хозяйстве, медицине и пищевой промышленности в качестве препаратов для борьбы с инфекциями. На основе генетического материала вирусов разработаны биотехнологические системы для наработки больших количеств белков в бактериях и культурах клеток. Элементы вирусной структуры все шире применяются для создания аналитических устройств, материалов для электроники и средств терапии.

Широкое использование вирусов обусловлено их уникальным строением и образом жизни: они полностью инертны вне организма хозяина и не имеют клеточного строения. Структура их генома очень разнообразна: вирусы могут содержать одну или несколько молекул РНК или ДНК, которые могут принимать линейную, кольцевую или сегментированную форму.

Роль клеточного ядра, защищающего геном вируса, выполняет капсид, состоящий из структурных белков и ферментов. Более сложно организованные вирусные частицы могут иметь дополнительные оболочки — суперкапсиды. Эти липопротеидные структуры включают в себя гликопротеины — белки, взаимодействующие с поверхностными клеточными рецепторами, что обеспечивает проникновение вирусов внутрь заражаемой клетки. Вирус может содержать более одного типа гликопротеинов, например, у вируса гриппа их два: гемагглютинины и нейраминидаза.

На поверхности липидной оболочки вируса гриппа располагаются два типа гликопротеинов — гемагглютинины и нейраминидаза («Наука из первых рук» №4 (75), 2017)
На поверхности липидной оболочки вируса гриппа располагаются два типа гликопротеинов — гемагглютинины и нейраминидаза. Вирусная частица прикрепляется к клетке путем формирования комплекса между молекулами гемагглютининов и сиаловой кислоты на поверхности клетки, а затем проникает внутрь нее путем эндоцитоза — впячивания мембраны и формирования пузырьков. Высвобождение вирусной РНК из везикулы происходит при снижении pH внутри нее до значения 5.0. В результате мембрана вируса сливается с эндосомальной мембраной, и генетический материал выходит наружу и проникает в ядро клетки. По: (Рябчикова, 2009)

Избирательное проникновение вирусов в клетки играет важную роль в их выживании. Вирион прикрепляется только к «подходящей» клетке, способной обеспечить его размножение. Проникновение вирусов в клетку может происходить по разным сценариям. Например, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ-1), инфицируя клетку, сливается своей оболочкой с плазматической мембраной клетки и сразу попадает в цитоплазму. Альтернативный способ, который использует вирус гриппа, эндоцитоз, один из естественных процессов, которые клетка использует при захвате вещества из внешней среды.

Природные наноконтейнеры

Виросомы можно использовать в качестве контейнеров для доставки лекарственных препаратов в клетки. Известно, что зачастую терапевтический потенциал лекарств, показанный ими в условиях «пробирки», не всегда может быть полностью реализован в организме из-за трудностей их транспортировки в клетки или преждевременной деградации в кровотоке. Для решения этих проблем пытались применять липосомы — искусственные липидные пузырьки, однако производить устойчивые липосомы, способные взаимодействовать только с определенными клетками, пока не научились.

Так возникла идея решить эту проблему с помощью виросом — вирусных частиц, освобожденных от генетического материала, но содержащих поверхностные гликопротеины. Подобные частицы обладают важным свойством: сохраняют способность избирательно связываться с определенными клетками, доставляя в них свое содержимое.

Для получения виросом вирусные частицы разлагают на составляющие компоненты с помощью неионных детергентов («Наука из первых рук» №4 (75), 2017)
Для получения виросом вирусные частицы разлагают на составляющие компоненты с помощью неионных детергентов, эффективно разрушающих межлипидные и липид-белковые связи и, как правило, не нарушающих структуру белков. Генетический материал вируса удаляют из раствора с помощью скоростного центрифугирования (около 100 000 g). При удалении детергента из оставшегося раствора происходит самосборка вирусной оболочки с сохранением первоначального набора белков. Для включения в виросомы лекарства его добавляют в раствор до удаления детергента. Один из подходов для включения макромолекул — проведение нескольких циклов замораживания-оттаивания виросом, при которых идет захват материала из раствора. Можно модифицировать липидную мембрану виросом (например, вводя холестерин), что повышает ее устойчивость, или присоединить к ней адресующие молекулы

Возможность доставки лекарственных средств с помощью виросом была показана на примере подавления синтеза белков вируса гепатита С в организме животных. В виросомы, сделанные на основе вируса Сендай, заключили короткие шпилечные РНК, способные ингибировать наработку белка вируса гепатита С в зараженных клетках. В результате внутривенного введения такого препарата удалось эффективно снизить количество исследуемого вирусного белка в клетках печени больных мышей (Subramanian et al., 2009).

В некоторых случаях виросомы необходимо «перепрограммировать» таким образом, чтобы нацелить их на определенные типы клеток. Эта задача становится особенно актуальной, когда речь идет о доставке лекарственных средств, провоцирующих клеточную гибель. В этом случае ошибки недопустимы.

Гликопротеины вируса гриппа можно ингибировать полиэтиленгликолем, после чего присоединить белки, способные специфично связываться только с определенными типами раковых клеток. В такой ситуации виросомы будут доставлять свое содержимое только в эти клетки-мишени. Пример удачного изменения специфичности виросом — это «перепрограммирование» виросом на основе вируса гриппа на эффективное слияние с клетками карциномы яичников (Mastrobattista et al., 2001).

Безопасные вакцины

Виросомы, несущие в себе или на своей поверхности антигены (структурные компоненты патогенных микроорганизмов, провоцирующие иммунную реакцию в организме), могут играть роль вакцин и способствовать наработке в организме реципиента клеток иммунологической памяти Т- и В-лимфоцитов. В отличие от «живых вакцин», когда реципиенту вводят ослабленные вирусные частицы с инактивированным генетическим материалом, вакцинация виросомами не несет риска случайного заражения пациента.

Варианты размещения антигена в виросомах на основе вируса гриппа («Наука из первых рук» №4 (75), 2017)
Наиболее часто вакцинные препараты на основе виросом конструируют из вируса гриппа. Причина — способность его белков-гемагглютининов связываться с молекулами сиаловой кислоты на поверхности антигенпрезентирующих клеток иммунной системы. Главная функция этих клеток — захват и презентация чужеродных белков лимфоцитам, отвечающим за развитие иммунного ответа и последующее формирование иммунологической памяти в организме. Если виросома будет содержать такой чужеродный антиген, он также попадет в антигенпрезентирующие клетки, и в организме может сформироваться устойчивая защита от патогена. На иллюстрации — варианты размещения антигена в виросомах на основе вируса гриппа: а — внутри виросомы; б — в комплексе с гемагглютининами; в — адсорбированные на мембране; г — погруженные в липидный слой

Виросомы можно использовать не только для профилактики, но и для лечения таких заболеваний, как, например, гепатит С. Предполагают, что основную роль в борьбе с этой инфекцией играют цитотоксические CD 8+ Т-лимфоциты: эти клетки являются «профессиональными убийцами» внутриклеточных паразитов, недосягаемых для системы гуморального иммунитета. «Увидев» антиген на мембране антигенпрезентирующих клеток, CD 8+ Т-лимфоциты взаимодействуют с ним своими рецепторами, после чего созревают, активируются и уничтожают зараженные клетки. Для активации T-клеточного иммунного ответа антиген должен попасть в антигенпрезентирующие клетки, и роль его носителя могут сыграть виросомы (Zubrrigen & Gluck, 1999).

При создании виросом против вируса гепатита С исследователи предложили намного более эффективный метод включения макромолекул, чем использование детергентов с последующим замораживанием-оттаиванием. Согласно этому методу, антиген сначала вводят в липосому. Для этого липиды «высушивают» до состояния «сухой пленки», а затем проводят их гидратацию («размачивают») в присутствии антигена. В результате путем самосборки образуются липидные пузырьки, содержащие нужный антиген (1). Виросомы создают из вирусных частиц с использованием неионных детергентов, включая в них поверхностные белки-гемагглютинины двух штаммов вируса гриппа — Х-31 и A/Sing, имеющие разный температурный диапазон активности (2). Х-31 активны при низких (<20°C) температурах и способны сливаться с липосомами, на поверхности которых отсутствует сиаловая кислота. Так образуется химерная конструкция, содержащая антиген (3). Гемагглютинины A/Sing, активные при температуре выше 25°C, обеспечивают слияние химерных виросом с мембраной антигенпрезентирующих клеток в организме (Amacker et al., 2005)

Виросомы могут применяться в качестве вакцин не только против вирусов, но и других патогенов. Так, у мышей происходит наработка антител против возбудителя малярии после введения им виросом на основе вируса гриппа, несущих на поверхности синтетические пептиды, соответствующие фрагментам белков плазмодия (Okitsu et al., 2008). Эффективные вакцинирующие препараты были разработаны на основе виросом, содержащих дифтерийный и столбнячный токсины. Сравнение действия таких препаратов и анатоксинов (токсинов, вызывающих иммунный ответ, но не проявляющих токсикологических свойств и служащих традиционными вакцинами против дифтерии и столбняка) показало, что в первом случае антитела нарабатываются более эффективно (Zubrrigen & Gluck, 1999).

Виросомы можно использовать и для иммунотерапии онкологических заболеваний — доставки в опухоль ассоциированных с раком антигенов в виде плазмидной ДНК или коротких пептидов. Такие виросомы способны активировать клетки иммунной системы даже более эффективно, чем антиген в нативном виде. В экспериментах на животных было показано, что антиген, специфичный для клеток меланомы Melan-A, доставляемый в виросомах на основе вируса гриппа, успешно проникает в плазматические дендритные клетки иммунной системы (популяция антигенпрезентирующих клеток крови). В результате происходит более эффективная активация Т-клеток, способных уничтожить раковые клетки, чем при введении свободного пептида. Этот эффект, по-видимому, обусловлен хорошей защищенностью антигена, находящегося в виросомах (Angel et al., 2007).

Использование виросом в терапии болезней человека и животных имеет существенные достоинства, главные из которых — нетоксичность и совместимость с большинством лекарственных средств. Кроме того, липидная оболочка обеспечивает надежную защиту заключенного в виросомах материала от преждевременной деградации. С помощью виросом-опосредованной терапии уже удалось добиться весьма многообещающих результатов. Некоторые созданные на их основе препараты, в основном вакцины, находятся на разных стадиях доклинических и клинических испытаний. К их числу относятся интраназальные вакцины против вируса гриппа, вакцина против РСВ-вируса, ВИЧ-инфекции.

Примером коммерчески доступных виросомных вакцин является препарат «Инфлексал» производства Швейцарии, который представляет собой виросомы, содержащие антигены против вирусов гриппа типов А и В. В последнее десятилетие именно Швейцария занимает лидирующие позиции по числу средств, вкладываемых в исследование и разработку препаратов на основе виросом.

Среди отечественных аналогов виросомных вакцин против вируса гриппа следует упомянуть вакцину «Грифор», разработанную на базе НПО «Микроген» (Москва) и официально разрешенную к медицинскому применению на территории РФ в 2008 г. К отечественным противогриппозным вакцинам нового поколения относится препарат «Ультрикс», эффективный в том числе в отношении свиного гриппа (Шамшева и др., 2014).

На сегодняшний день в мире можно выделить несколько групп, занимающихся доставкой терапевтических нуклеиновых кислот, в том числе и малых интерферирующих РНК (siRNA), в клетки млекопитающих с помощью виросом (de Jonge et al., 2006). Основные затруднения, с которыми приходится сталкиваться при приготовлении таких виросомных препаратов, связаны с эффективностью включения препарата в состав виросом, а также адресной доставкой в определенные типы клеток. Сегодня в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск) ведутся работы по получению виросом стандартного качества со стабильными свойствами, в том числе обладающих способностью к адресной доставке терапевтических нуклеиновых кислот. Уже разработаны методы включения этих макромолекул в оболочки вируса (Власов и др., 1988, 1989). В дальнейшем планируется создать виросомные препараты, содержащие терапевтические нуклеиновые кислоты, и оценить их воздействие на различные типы раковых клеток человека.