Структура вириона и свойства белков вируса Эбола
Вирионы вируса Эбола (Вирус Эбола) обычно имеют нитевидную форму, диаметр нитей составляет около 80 нм, и в их состав входят семь структурных белков. Средняя длина частиц вируса Эбола варьирует в пределах от 974 до 1086 нм. При этом их длина не зависит от размера вирусной геномной РНК. Показано, что вирусоподобные частицы, содержащие минигеном Вирус Эбола, имеющий длину всего 2 т.н.о., по морфологии неотличимы от частиц аутентичного Вирус Эбола.
Электронномикроскопические исследования показали, что вирусные частицы Вирус Эбола состоят из центральной структуры — нуклеокапсида или рибонуклеопротеидного (РНП) комплекса, состоящего из молекул белка NP, покрывающих геномную РНК и образующих вокруг нее спиралевидный слой, а также трех дополнительных минорных белков: VP35, VP30 и L. Нуклеокапсид окружен липидной оболочкой, происходящей из плазматической мембраны клетки-хозяина. На поверхности вирионов присутствуют глобулярные структуры в виде шипов, образованные трансмембранным гликопротеином GP Структурные белки VP24 и VP40, по всей видимости, локализуются на внутренней стороне мембраны.
Трансмембранный гликопротеин I типа GP располагается в виде тримсров на поверхности вирусных частиц. Длина белковой цепи гликопротеина Вирус Эбола составляет 676 а.о., а молекулярная масса мономера составляет 125 кДа. Центральный домен белка GP наиболее вариабелен и высоко гидрофилен. В его состав входит множество N- и О-связанных гликанон, которые составляют более половины молекулярной массы всего белка.
Поверхностный гликопротеин отличает от прочих структурных белков Вирус Эбола сложная стратегия синтеза и посттрансляционного созревания. мРНК полноразмерного GP синтезируется в результате транскрипционного редактирования, добавления РНК- зависимой РНК-полимеразой дополнительного остатка аденина во время синтеза последовательности, комплементарной полиуридиновому тракту (сайту редактирования), находящегося внутри гена GP. Это явление, вследствие которого происходит сдвиг рамки считывания в позицию -1, наблюдается приблизительно у 20% GP-специфических мРИК. 80% GP-специфических мРНК представлены нередактированными транскриптами, с которых синтезируется неструктурный секретируемый гликопротенн sGP.
Первичный продукт трансляции prcGP подвергается многоступенчатому процессингу в эндоплазматическом ретикулуме аппарате Гольджи, который включает в себя отщепление сигнального пептида, N-гликозилирование, олигомеризацию и О- гликозилирование, а также протеолитическое расщепление на большую N-концевую субъединицу GPi (33-501 а.о.) и малую С-концевую субъединицу GP2 (502-676 а.о.) в цистернах аппарата Гольджи субтилизин-подобной конвертазой фурином Сайтом узнавания фурина является короткая последовательность из положительно заряженных а.о (498-501 о.а.).
Таким образом, зрелый поверхностный гликопротеин Вирус Эбола состоит из двух различных по размеру и функциям субъединиц GPi и GP2 . GPi является рецептор- связывающей субъединицей, a GP2 содержит трансмембранный якорь и домен слияния, гомологичный доменам слияния гликопротеинов ретровирусов.
Значительный объем исследований гликопротеина Вирус Эбола посвящен изучению цитотоксического действия этого белка При экспрессии гена GP в составе гибридных плазмид под контролем промоторов, распознаваемых эукариотическими Р11К- полимеразами, в культурах различных клеточных линий, в том числе и первичных, а также эксплантатах артерий животных и человека, наблюдалось нарушение адгезии, отслаивание и округление клеток. Авторы одной из работ связывают данное явление со снижением уровня экспрессии на поверхности трансформированных гибридными плазмидами клеток и предполагают, что GP способен связывать в цитоплазме клетки, не позволяя им достигнуть ее мембраны. Детерминанты цитотоксичности были картированы в трансмембранном домене GP2 субъединицы и С-концевой области GPi, в участке, обогащенном остатками серина и треонина (муцин-подобном домене). Введение различных мутаций в муцип-подобный домен не приводило к снижению цитотоксического действия GP, однако полное удаление этого домена приводило к подавлению цитотоксичности гликопротеина, не оказывая при этом влияния на его структуру. Продемонстрирована способность GP, находящегося в составе ВПЧ, так же как и живого Вирус Эбола in vivo, индуцировать секрецию цитокинов (ФНО-а, ИЛ-6, ИЛ-1(3) и хемокина ИЛ-8 в культуре макрофагов человека. Для индукции, по-видимому, большое значение имеет стабилизированная четвертичная структура GP, связанного с мембраной, поскольку рекомбинантный GP в растворимой форме индуцирует макрофаги со значительно меньшей эффективностью.
Кроме того, известно, что частицы Вирус Эбола обладают и иммуносупрессивным свойствами. Так было показано, что интактные вирусные частицы вызывают ингибирование пролиферации лимфоцитов in vitro. Было выяснено, что супрессивными свойствами непосредственно обладает 469 а.о. GPi субъединица вирусного гликопротеина, а также рекомбинантный олигопептид длиной 40 а.о., соответствующий последовательности из N-концевого района GP.
Было показано, что GP является антигеном pi иммуногеном. В его структуре было выявлено несколько эпитопов: один из них (линейный) был картирован составе субъединицы GP2, ключевым аминокислотным остатком для связывания моноклональных антител с данным эпитопом являлся остаток His-549; второй (конформационпый) — в составе субъединицы GPi, состоял pi3 трех аминокислотных остатков: Arg-134, Phe-194 и Leu-199.
Структурный белок вириона 40 (VP40) является основным компонентом матрикса вирионов Вирус Эбола. Его размер составляет 326 а.о. Этот белок негомологичен ни одному Pi3 матриксных белков других представителей порядка Mononegavirales.
VP40 является мажорным компонентом вирионов Вирус Эбола и играет важнейшую роль на последних стадиях сборки вирионов. Свои функции он выполняет благодаря наличию в его составе нескольких функциональных мотивов .В первую очередь это вирусные L-домены (от английского late): РТАР, YXXL, N-концевые PPXY, а также консервативные СН-,-связывающие сайты.
В результате изучения кристаллической структуры VP40 в его составе были выявлены два структурных домена, имеющих идентичную глобулярную структуру, состоящую из (3-складок, соединенных коротким гибким линейным участком. Присущее белку VP40 Вирус Эбола преобладание (3-складчатых структур над а- спиральными нехарактерно для большинства вирусных матриксных белков. Как следует из биохимических и структурных исследований, в составе С-концевого домена содержится большое количество экспонированных на поверхность гидрофобных остатков, располагающихся в наиболее консервативных среди представителей семейства Filoviriade участках. Гидрофобные аминокислотные остатки обеспечивают взаимодействие VP40 с плазмолеммой. Помимо С-концевых гидрофобных аминокислот, N-концевой домен также может связываться с мембраной посредством содержащегося в нем тракта положительно заряженных аминокислот. Между двумя структурными доменами VP40 существует лишь одно спираль-спиральное взаимодействие и гидрофобная молния. Интересно, что С-концевая область белка лежит на междоменной поверхности. Эта поверхность имеет специфическую пространственную структуру и играет важную функциональную роль. Усечение VP40 с С-конца (в позиции 212) приводит к спонтанной гексамеризации белка, образованию кольцевой структуры и потере способности VP40 связываться с мембраной. Это позволяет предполагать, что С- концевой домен в жесткой мономерной структуре препятствует олигомеризации YT40,по-видимому, имеющей место в процессе сборки вириона. Данных о протеолитическом расщеплении VP40 в процессе вирусной инфекции нет, однако in vivo MOiyr происходить конформационные изменения белка, в результате которых олигомеризация становится возможной. В недавних исследованиях было показано, что гексамеризация может инициироваться изменением конформации междоменной поверхности при обработке мочевиной, отщеплении семи С-концевых аминокислотных остатков, лежащих на этой поверхности, либо при связывании полноразмерного VP40 с эндосомами in vitro.
VP40 играет ключевую роль в процессе сборки вирионов Вирус Эбола. Экспрессия полноразмерного гена VP40 в составе гибридных плазмид в культуре клеток приводит к выходу в культуральную жидкость ВПЧ, образуемых рекомбинантным белком. Необходимость наличия L-доменов для образования ВПЧ in vitro была продемонстрирована в нескольких работах. Введение мутаций в районы 11- доменов полностью выключает способность VP40 высвобождаться в виде ВПЧ из клеточных культур — продуцентов VP40. Одной из исследовательских групп была предложена модель сборки филовирусных частиц с участием VP40, состоящая из трех стадий. Согласно этой модели на первой стадии происходит взаимодействие VP40 с липидным бислоем, на второй — конформационные изменения VP40, приводящие к его гексамеризации, и на последней стадии, предположительно, происходит образование сетчатой структуры, состоящей из гексамеров VP40, соединенных С-концевыми доменами, на внутренней стороне клеточной мембраны, и взаимодействующих с цитоплазматическими или трансмембранными доменами молекул GP.
Благодаря наличию в структуре VP40 L-домеиов, VP40 взаимодействует с клеточными белками, такими, как убиквитин лигаза Nedd4 и TSG101, содержащим UEV-домен (от англ, ubiquitin enzyme variant).
Показано, что in vitro в результате взаимодействия VP40 с дрожжевым гомологом Nedd4 Rsp5p образуются конъюгированные с убиквитином формы VP40, однако их наличие в системе in vivo выявлено не было. Таким образом, функциональное значение присоединения молекул убиквитпна к белку VP40 не ясно.
Матрнксный белок VP40 играет ключевую роль в процессах сборки и почкования вирусных частиц. Кроме того, он осуществляет транспортировку вирусных компонентов из цитоплазмы к мембране клетки. Показано, что VP40 непосредственно взаимодействует in vitro и in vivo с тубулином, основным компонентом микротрубочек. В результате этого взаимодействия микротрубочки реорганизуются в пучки, устойчивые к действию деполимеризующих агентов. Эти явления наблюдаются не только при экспрессии VP40 в культуре клеток, но и при инфекции клеток вирусом Эбола. Делегирование 18 С-концевых аминокислотных остатков приводит к потере способности VP40 связываться с тубулином. Кроме того, VP40 имеет гомологию с клеточными белками, стабилизирующими микротрубочки, такими как МАР2 и Таи. В последовательности белка VP40 был обнаружен С-концевой домен, занимающий позиции 223-253 а.о., имеющий гомологию с тубулин-связывающими повторами МАР2 и Таи. В N-концевой части VP40 присутствуют обогащенные пролином мотивы, также обнаруженные и в тубулин-связывающих белках.
Структурный белок вириона 24 (VP24) длиной 251 а.о., также входит в состав матрикса вирионов Вирус Эбола, однако в меньших количествах, чем VP40. Хотя наименование связано с молекулярной массой белка, которая составляет 24 кДа, показаны различия в электрофоретической подвижности белков VP24 различных штаммов Вирус Эбола. В частности, снижение электрофоретической подвижности VP24 показано для высоковирулентного для морских свинок варианта Вирус Эбола SMC, полученного в результате проведения нескольких пассажей Вирус Эбола на этих животных.
Белок VP24 ассоциирован с мембраной зрелого вириона. В отличие от VP40 белок VP24 полностью не диссоциирует из РНП-комплекса в изотонических условиях. YP24 обогащен гидрофобными аминокислотными остатками, особенно высокое их содержание выявлено в районе, занимающем позиции 90-130 а.о. В N- концевом районе белка имеется единичный цистеиновый остаток в позиции 27. Кроме того, аминокислотная последовательность VP24 содержит три потенциальных сайта N- гликозирования (в позициях 84, 185 и 246 а.о.), однако данная посттрансляционная модификация для VP24 пока не выявлена. VP24 связывается с липидным бислоем, и, кроме того, обладает способностью к олигомеризации в физиологических условиях, образуя преимущественно тетрамерные формы с молекулярной массой 112 кДа. Способность к олигомеризации является общим свойством матриксных белков различных вирусов и, по всей видимости, важна для процесса сборки вирусных частиц. N-концевые аминокислотные остатки необходимы для теграмеризации VP24. Делетирование фрагментов различной длины с N-конца белка приводит к возрастанию тенденции к агрегации молекул VP24 и образованию олигомеров более высокого порядка.
Роль VP24 в жизненном цикле филовирусов на сегодняшний день остается наименее ясной, однако, эксперименты по селектированию штаммов с измененной вирулентностью, таких как адаптированный к морским свинкам вариант 8МС, указывают на критичность единичных аминокислотных замен в VP24 для изменения патогенных свойств Вирус Эбола.
Кроме того, в двух работах было показано участие VP24 в процессе сборки вирусных частиц. Huang с соавт. (2002) постулировали, что белок VP24, наряду с NP 32и VP35, необходим для сборки вирусных нуклеокапсидов. Поскольку сам белок VP24 при этом не входит в состав образующихся филаментозных структур, было сделано предположение, что он выполняет функцию катализатора взаимодействия между NP и VP35. Исследование, проведенное Licata с соавт. (2004), показало, что одновременная экспрессия VP40, способного самостоятельно образовывать почкующиеся ВПЧ, с NP и VP24 приводит к более эффективной продукции ВПЧ, по сравнению с экспрессией вирусных генов VP40+VP24 и VP40+NP. Авторы предположили, что VP24 опосредует взаимодействие NP с VP40 в процессе сборки вирионов. Интересно, что одно из последних исследований с применением методов обратной генетики подвергает сомнению критическую значимость VP24 для процесса сборки эболаподобных вирусных частиц. Так было показано, что при экспрессии структурных генов, минигеном способен формировать ВПЧ, морфологически идентичных нативным вирусным частицам. При этом VP24 не является необходимым компонентном не только сборки, но и почкования ВПЧ.
Нукдеопротеин (NP) кодируется геном, расположенным в 3’-концевой области геномной РНК. NP составляет основную массу белков вириона. Молекулярная масса белка NP, рассчитанная на основе его первичной последовательности (739 а.о.), составляет 83 кДа, что в значительной мере не соответствует электрофоретической подвижности этого белка (115 кДа). Различия этих характеристик объясняется наличием модификаций некоторых аминокислотных остатков в составе белка. Первоначально было выявлено несколько фосфорилированных аминокислотных остатков, что, тем не менее, не объясняло снижение электрофоретической подвижности NP. Затем было обнаружено, что NP также содержит О-связанные гликаны, в состав которых входят остатки N-ацетил-глгокозамина, N-ацетил-галактозамина, а также остатки сиаловой кислоты. Скорее всего, модификации NP важны для образования стабильного РНП- комплекса в процессе сборки вирусной частицы.
РНП-комлекс, образуемый вирусными белками NP, VP35, L и вирусной геномной РНК, является минимальной структурой, обеспечивающей репликацию вирусного генома. NP является основным структурным компонентом РНП- комплекса. Белок NP обладает свойством гомоолигомеризации Показано, что это свойство белка связано, прежде всего, с N-концевым (450 а.о.) и центральным районом белка NP. Кроме того, известно, что удаление 234 С-концевых аминокислот изменяет пространственную структуру образующихся нуклеокапсидов, Возможно, одной из причин изменений является то, что эта часть белка NP отвечает за его взаимодействие с другими компонентами нуклеокапенда. К примеру, уже показано, что 50 С-концевых а.о. отвечают за взаимодействие NP с белком VP40.
Белок NP является антигеном и иммуногеном. Было установлено, что антигенные детерминанты (линейные эпитопы) белка NP локализованы в 110-ти С-концевых а.о. С- терминального района.
Высокомолекулярный белок L (от англ, large) кодируется геном, расположенном в 5’-концевом районе линейного филовируоного генома. Белок L, входящий в состав Р.НП- комплекса вирионов Вирус Эбола, имеет длину 2212 а.о. и молекулярную массу около 267 кДа.
В результате компьютерного анализа была выявлена значительная гомология между белками L различных видов вирусов с негативным РНК-геномом. Существует целый ряд общих черт, характерных для белков L: высокое содержание остатков лейцина и изолейцина, большой суммарный положительный заряд, наличие нескольких кластеровосновных аминокислотных остатков, потенциальные центры связывания АТФ, два близко расположенных остатка цистеина в С-концевом районе белка, а также локализация генов, кодирующих эти белки.
