Особенности диагностики коронавирусной инфекции
Для диагностики коронавирусной инфекции (КВИ) в настоящее время используют следующие методы:
— выделение вируса в клеточных и/или органных культурах;
— обнаружение достоверного прироста величины титров сывороточных или секреторных антител к КВ;
— выявление в клиническом материале вирусных частиц, вирусных антигенов или нуклеиновых кислот (РНК).
Вирусовыделение является наиболее трудоемким и длительным по времени методом диагностики КВИ, что, главным образом, связано с чрезвычайной прихотливостью КВ к условиям культивирования. Тем не менее, КВ может быть выделен из носовых и глоточных смывов, а также из носоглоточных аспиратов инфицированных индивидуумов. Вирусовыделение достигает определяемых величин ко времени появления начальных симптомов заболевания и продолжается 1-4 дня.
Коронавирус 229Е и родственные ему штаммы выделяются в монослойных культурах фибробластов легких эмбриона человека, примером которых могут служить клеточные культуры WI-38 и MRC-5.
Первичное вирусовыделение штаммов, родственных ОС43, на клеточных культурах невозможно, оно осуществляется только на органных культурах. Используют ткани эмбриона человека — фрагменты эпителия трахеи или полости носа.
Культивирование кишечных КВ представляет еще более сложную проблему и осуществляется на культурах клеток кишечника плода, первичных культурах почки эмбриона человека и на культуре клеток опухоли прямой кишки человека (HRT-18).
Обнаружение достоверного прироста титра сывороточных антител к КВ долгое время являлось практически единственным способом диагностики КВИ как у нас в стране, так и за рубежом. Большинство данных, касающихся особенностей эпидемиологии КВ, также было получено с помощью серологических исследований.
С этой целью использовались реакции нейтрализации (PH), связывания комплемента (РСК), торможения гемагглютинации (РТГА) и непрямой ге- магглютинации (РИГА). Постановка РТГ’А возможна только с участием II антигенной группы КВ, родственных штамму ОС43, у которых в отличие от КВ I группы, присутствует НЕ-белок — гемагглютинин-эстераза, индуцирующий образование вируснейтрализующих и гемагглютинирующих антител, которые можно выявить с помощью РТГА. В НИИ гриппа РАМН был предложен способ обнаружения специфических секреторных антител к респираторным вирусам, в том числе и КВ, во входных воротах инфекции, основанный на модифицированном варианте РИГА, когда антитела определяются в парных смывах из носа и/или зева.
Для диагностики КВИ предложен также метод иммунного блотинга, основанный на обнаружении антител к специфическим белкам вируса, иммобилизованным на нитроцеллюлозной подложке — вестерн-блотинг. Однако более чувствительным методом является иммуноферментный анализ (ИФА), а именно его вариант — ELISA-тест, который позволяет также определять антигены КВ и в образцах фекалий.
Третья группа методов диагностики КВИ включает в себя ЭМИ, ИФЛ метод, а также молекулярно-биологические методы.
Электронно-микроскопическое исследование до настоящего времени остается основным методом в диагностике гастроэнтеритов КВ этиологии, поскольку выделение кишечных КВ в культуре клеток до сих нор представляет значительные трудности. Однако данный метод трудоемок, требует наличия дорогостоящего оборудования и поэтому в широкой клинической практике его использование ограничено.
Иммунофлюоресцентный метод относится к экспресс-методам и позволяет обнаружить антиген КВ в клетках носоглотки инфицированных индивидуумов в течение нескольких часов, но до недавнего времени его применение как за рубежом, так и в нашей стране было невозможно из-за отсутствия соответствующих диагностических препаратов. Следует отметить, что J. Sizun и соавт. (1998) в эксперименте in vitro удалось показать, что результаты диагностики КВИ с использованием флюоресцирующих моноклональных антител к КВ 229Е и ОС43 сопоставимы с результатами ПЦР.
К молекулярно-биологическим методам относятся slot-blot- гибридизация (метод молекулярного зонда) и ПЦР и его модификации — ПЦР в реальном времени (RT-PCR — real-time polymerase chain reaction), гнездная ПЦР (nested PCR).
Разработка метода ПЦР для диагностики КВИ впервые была осуществлена Myint и соавт. в 1994 году. Этому предшествовало секвенирование в 1989 году N-гена КВ 229Е и N-гена КВ ОС43, результаты которого позволили осуществить подбор необходимых праймеров. В 2001 г. A. Vabret и соавт. предложили использовать праймеры для амплификации фрагмента М-гена КВ ОС43 и 229Е.
Данные методы, особенно ПЦР и ее разновидности, несмотря на свою дороговизну, являются высокочувствительными и специфичными, позволяют выявлять незначительные количества КВ, в связи с чем, по мнению авторов,их желательно использовать для исследования респираторных секретов и других материалов от больных с целью диагностики КВИ.
